Microscopio Óptico (MO)
Consiste en un tubo con lentes de vidrio en cada extremo, debido a que contiene varias lentes, el microscopio óptico moderno se denomina microscopio compuesto. La luz visible pasa a través de la muestra que se está observando y por medio de las lentes; las lentes refractan (desvían) la luz, ampliando la imagen; y las imágenes obtenidas se conocen como micrografías ópticas (MO).
Los mejores microscopios ópticos tienen un poder de resolución de 0,2 micrómetros, o 200 nanómetros, aproximadamente 500 veces mayor que el del ojo, y normalmente amplían un objeto más de 2000 veces. En este sentido, con él se pueden distinguir las estructuras más grandes dentro de las células eucarióticas y también células procarióticas individuales. Sin embargo, no se puede observar la estructura interna de las células procarióticas ni distinguir entre las estructuras más finas de las células eucarióticas.
La luz visible utilizada por los microscopios ópticos tiene longitudes de onda que oscilan de aproximadamente 400 nm (violeta) a 700 nm (rojo); esto limita la resolución de los microscopios ópticos a detalles no más pequeños que el diámetro de una célula bacteriana pequeña (aproximadamente 0.2 μm).
Microscopio Electrónico (ME)
Es una herramienta potente para estudiar las estructuras celulares, pero tiene limitaciones. Los métodos que se utilizan con el fin de preparar las células para microscopia electrónica producen su muerte y pueden alterar su estructura. Además, la microscopia electrónica proporciona pocas pistas acerca de las funciones de los orgánulos o de otros componentes de la célula.
Algunos microscopios electrónicos tienen poder de resolución de tan sólo 1 nm. Esto es posible porque los electrones tienen longitudes de onda muy cortas, del orden de aproximadamente 0.1 a 0.2 nm. Este alto grado de resolución permite amplificaciones de más de 1 millón de veces comparadas con las ampliaciones típicas de no más de 1.500 a 2.000 veces del microscopio óptico.
La imagen formada no es visible directamente; el propio haz de electrones está formado por electrones cargados de energía que, debido a su carga negativa, pueden enfocarse con electroimanes, igual que una imagen se enfoca con las lentes del microscopio óptico. Las micrografías electrónicas son en blanco y negro, y con frecuencia son coloreadas para resaltar diversas estructuras.
Tipos
a) Microscopio electrónico de transmisión (MET): El poder de resolución es 1.000 veces respecto del microscopio óptico, esto se logra utilizando “iluminación” de una longitud de onda mucho más corta, que consiste en haces de electrones en lugar de rayos de luz. Por lo que, las áreas del espécimen que permiten la transmisión de más electrones (“regiones electrotransparentes”) aparecen brillantes y las áreas que dispersan los electrones (“regiones electroopacas”) son oscuras.
Asimismo, la microscopia electrónica de transmisión suministra en la actualidad un poder de resolución de aproximadamente 0,2 nanómetros, unas 500 mil veces mayor que el del ojo humano, esa medida equivale más o menos al doble del diámetro de un átomo de hidrógeno. No obstante, la muestra se sumerge en resinas y después se hacen cortes extraordinariamente fi nos (50 a 100 nm de grosor) con una cuchilla de vidrio o de diamante. Después se coloca un corte sobre una pequeña rejilla metálica. El haz de electrones pasa a través de la muestra y después incide sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla fluorescente.
b) Microscopio electrónico de barrido (MEB): El poder de resolución es sólo de aproximadamente 10 nanómetros; sin embargo este instrumento se ha transformado en una herramienta valiosa para los biólogos. En la microscopia electrónica de barrido los electrones que se registran provienen de la superficie del espécimen y no de un corte a través de éste. Para ser observadas, las muestras deben ser sometidas a un tratamiento previo.
El haz de electrones no pasa a través de la muestra, en su lugar, la muestra se recubre con una fina película de oro o algún otro metal. Cuando el haz de electrones golpea varios puntos de la superficie de la muestra, se emiten electrones secundarios cuya intensidad varía dependiendo del contorno de la superficie. Los patrones de emisión registrados de los electrones secundarios proporcionan una imagen 3-D de la superficie. El MEB da información acerca de la forma y características externas de la muestra que no se pueden obtener con el MET.
Comparaciones
El MO, el MET y el MEB se enfocan utilizando principios similares. Un haz de luz o un haz de electrones se proyectan por medio de un condensador sobre la muestra y ésta se amplifica a través del objetivo y el ocular en el caso del microscopio óptico y por el objetivo, y el proyector en el caso del MET. La imagen del MET se proyecta en una pantalla fluorescente y la imagen del MEB se ve en una especie de pantalla de televisión. Realmente, las lentes del microscopio electrónico son imanes que desvían el haz de electrones.
Por lo tanto, en el microscopio óptico como en el microscopio electrónico de transmisión, la formación de una imagen con un contraste perceptible exige que diferentes partes de la célula difieran en su transparencia al haz de iluminación, ya sean rayos de luz o electrones. En este sentido, las partes del espécimen que permiten el paso de la luz o de los electrones aparecen brillantes, mientras que las partes que bloquean el paso del haz de iluminación aparecen oscuras.
En cambio, en el microscopio electrónico de barrido la intensidad de la señal de electrones dispersados por la muestra depende de la inclinación local de la superficie de ésta con respecto al haz. Así, un borde agudo o saliente genera una mayor dispersión de electrones hacia el detector y aparece más claro que una fisura o un hueco. Este hecho posibilita interpretar una micrografía electrónica de manera análoga a una micrografía óptica.
No obstante, para crear suficiente contraste cuando se usa el microscopio óptico, las células deben ser tratadas con colorantes u otras sustancias que se adhieran diferencialmente a componentes subcelulares específicos, o reaccionen con ellos, produciendo regiones de opacidad diferente. Para el microscopio electrónico los especímenes se tratan por lo general con compuestos de metales pesados. Los especímenes que serán estudiados usando un microscopio óptico convencional o un microscopio electrónico de transmisión deben ser fijados, teñidos, deshidratados (para el microscopio electrónico), incluidos y seccionados en cortes finos.
Estereomicroscopio, Microscopio de Disección o Lupa Estereoscópica
Es un tipo de microscopio óptico que proporciona un aumento menor que el microscopio compuesto, pero produce una imagen tridimensional. Esto hace que el microscopio de disección sea bueno para ver objetos que son más grandes que unas pocas células, pero demasiado pequeños para verlos en detalle con el ojo humano. Se utiliza con frecuencia para trabajar con muestras que tienen mayor necesidad de ser diseccionadas para ver con más detalle las partes pequeñas que las componen, sean de plantas, insectos e incluso paneles electrónicos. O simplemente para ver objetos como sellos, monedas, rocas, minerales, fósiles, especímenes arqueológicos e incluso joyas (piedras preciosas).
